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產品說明：

使用說明：

產品描述：

細胞生物學實驗中常使用Fluo-3, AM作為一種熒光探針來檢測細胞內鈣離子濃度變化。其檢測原理基于Fluo-3,AM可穿透細胞膜進入細胞，之后被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是，當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，熒光會增加60至80倍。

Fluo-4, AM是鈣指示劑Fluo-3,AM的升級版本，主要變化為后者分子上的兩個氯原子被Fluo-4,AM上的氟所取代，該結構上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測信號更強。

本產品為Fluo-4,AM粉末狀，用于細胞內鈣離子檢測時，Fluo-4, AM的常用濃度為0.5-5 μM。

操作說明：

一. 需要試劑準備：

1. （可選）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30 min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. Hanks?balanced salt solution

二、操作步驟： 

1）Fluo-4,AM母液的配制：向 Fluo-4, AM中加入適量DMSO，配制成1-5 mM的儲存液，DMSO的加入量根據Fluo-4,AM（MW1096.94）分子量進行計算（如：若配制成1mM的母液，需向50 ug Fluo-4,AM中加入45.6 uL DMSO）。

【注】：溶解用的DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導致 AM 體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。

2）Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS將Fluo-4,AM稀釋成1-5μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 μM工作液，用1 mL HBSS溶液稀釋4 μL 1 mM母液即可。

【注】：①推薦該探針加載濃度在4-5 μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

② Fluo-4,AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3）（可選）如果Fluo-4進入細胞的效果不好，可向 Fluo-4, AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fluo-4, AM 在 HBSS中聚合并能幫助其進入細胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fluo-4,AM的穩定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議將其加入儲存液長期保存。

4）取出預培養的細胞，除去培養基，使用 HBSS 溶液洗滌細胞 3次。

【注】：如果使用含血清的培養基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低 Fluo 4-AM 進入細胞的效果。另外含有酚紅的培養基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養基殘留。

5）將 Fluo-4, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。在37℃培養10-60 min，然后除去 Fluo 4-AM 工作液。

【注】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30分鐘，看熒光效果：如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

6）用HBSS溶液洗滌細胞 3 次，以充分去除殘留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細胞。

7）37℃培養箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細胞內的完全去酯化作用。

8）用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，激發波長 494 nm，發射波長 516 nm。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并帶一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。