Calcein AM, Ultra Pure Grade 鈣黃綠素（綠色）
產品描述
Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性的活細胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水性，使其能輕易穿透活細胞膜。而且封閉結合鈣離子的分子部分，本身不發熒光。一旦進入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內鈣離子結合，產生強烈的綠色熒光。因不具有細胞膜滲透性，從而被保留在胞內。與其它活細胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細胞染色探針，因細胞毒性很低，而且不會抑制任何細胞功能如增殖或淋巴細胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實驗結果十分可信，與標準的51Cr釋放法所得結果一致。
由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細胞進行標記，這一特征使其非常適合用來檢測細胞活力和細胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯合使用，因其僅能穿過死細胞膜的無序區域到達細胞核，嵌入細胞的DNA雙螺旋區域，并產生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。用545 nm激發，僅可觀察到死細胞。結合這些特點，Calcein, AM和PI經常被結合用作活細胞和死細胞的雙重染色。
本品以粉末形式提供，超純級別（≥95%），可與碘化丙啶PI聯合使用，進行活細胞和死細胞的雙重染色。
產品特性
1） CAS NO：148504-34-1
2）同義名：鈣黃綠素乙酰甲酯；3′-O-乙酰胺-2′,7′-二(羧乙基)-4或5-羧基熒光素，二乙酰甲酯；
3）分子式：C46H46N2O23
4）分子量：994.86
5）純度：≥95%（HPLC）
6）外觀：白色或淺黃色結晶粉末
7）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）
8）化學結構式：
保存與運輸方法
保存：-20℃干燥保存，避免強光直射，有效期一年。
運輸：冰袋運輸。
注意事項
1）熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。
3） Calcein-AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein-AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。
4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
A， 儲存液制備
儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往50μg Calcein, AM（Mw：994.86）內加入10μl 細胞培養級別的DMSO即可。
B， 20% Pluronic F-127制備【可選】
稱取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。
C， 染色步驟
大多數實驗體系中Calcein, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。
1） 取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。
【注意】：有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長期保存，需現配現用。
2） 對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。
3） 去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。
4） 用1/10細胞培養基體積的Calcein, AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育15～30min。
【注意】：若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內以降低Calcein泄露到胞外。
5） 用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。
【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗。用含合適濾光片（Ex/Em= 490nm/515nm）的熒光顯微鏡進行檢測。
