Alexa Fluor 488-Streptavidin Alexa Fluor 488標(biāo)記鏈霉親和素
Alexa Fluor 488-Streptavidin（Alexa Fluor 488標(biāo)記鏈霉親和素）是鏈霉親和素（Streptavidin）與Alexa Fluor 488熒光染料通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)形成的生物探針，結(jié)合了鏈霉親和素對(duì)生物素的高親和力與Alexa Fluor 488的高亮度熒光特性，是生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的核心熒光標(biāo)記工具，廣泛應(yīng)用于免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、原位雜交、蛋白質(zhì)印跡等生命科學(xué)研究領(lǐng)域，兼具高特異性、強(qiáng)熒光穩(wěn)定性和良好的生物相容性。
一、產(chǎn)品基本信息
1. 基礎(chǔ)參數(shù)
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參數(shù)項(xiàng)
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詳情
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中文名稱(chēng)
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Alexa Fluor 488標(biāo)記鏈霉親和素
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英文名稱(chēng)
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Alexa Fluor 488-Streptavidin；Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate
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CAS 號(hào)
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無(wú)單一CAS號(hào)（偶聯(lián)物混合物），鏈霉親和素CAS：9013-20-1
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分子結(jié)構(gòu)
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鏈霉親和素（四聚體蛋白）與Alexa Fluor 488（磺化熒光素衍生物）通過(guò)酰胺鍵共價(jià)偶聯(lián)
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外觀
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凍干粉或淡黃色至橙黃色澄清溶液（取決于濃度），無(wú)可見(jiàn)沉淀
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光學(xué)特性
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激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)519nm，量子產(chǎn)率0.92，斯托克斯位移24nm
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溶解性
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易溶于PBS、TBS等緩沖液，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，忌用含巰基還原劑的溶液
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儲(chǔ)存
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-20℃避光密封保存，避免反復(fù)凍融；溶解后4℃短期保存（≤1周）
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2. 核心特性與用途
核心特性：鏈霉親和素為非糖基化四聚體蛋白，等電點(diǎn)pI≈5-6，每個(gè)亞基可特異性結(jié)合1個(gè)生物素分子，結(jié)合常數(shù)Kd≈10?1? M，是非共價(jià)相互作用中親和力最強(qiáng)的組合之一，背景極低；Alexa Fluor 488熒光亮度高，抗光漂白性為FITC的10倍，水溶性良好，匹配488nm激光光源，兼容多種熒光檢測(cè)設(shè)備；偶聯(lián)物保留鏈霉親和素的生物素結(jié)合活性和Alexa Fluor 488的熒光特性，生物相容性佳、低毒性，不影響細(xì)胞活性或生物分子功能，耐受pH 4.0-9.0、高鹽及0-40℃溫度范圍。
主要應(yīng)用：
- 免疫熒光與顯微鏡成像：標(biāo)記生物素化一抗或二抗，定位細(xì)胞/組織中目標(biāo)抗原（如膜蛋白、核酸），支持共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡可視化及多色成像（可與AF594、AF647等聯(lián)用），適用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、細(xì)胞器共定位等實(shí)驗(yàn)；
- 流式細(xì)胞術(shù)：標(biāo)記生物素化抗體（如CD4、CD8），實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)志物的定量檢測(cè)與多色分選，熒光通道無(wú)串?dāng)_，信號(hào)穩(wěn)定；
- 信號(hào)放大：在ELISA、免疫組化、原位雜交（FISH）中，通過(guò)鏈霉親和素-生物素橋接放大信號(hào)，提升低豐度靶標(biāo)（如腫瘤標(biāo)志物、病毒抗原）的檢測(cè)靈敏度；
- 蛋白質(zhì)與核酸檢測(cè)：用于Western blot、蛋白芯片等實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)、核酸探針，提供高靈敏度熒光信號(hào)；
- 活細(xì)胞成像：追蹤活細(xì)胞內(nèi)生物素化分子（如蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞途徑），支持長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察，不影響細(xì)胞正常生理活動(dòng)。
二、標(biāo)準(zhǔn)使用流程（分場(chǎng)景）
1. 通用實(shí)驗(yàn)原則
- 溶解與稀釋?zhuān)簝龈煞坌栌脽o(wú)生物素的PBS或TBS緩沖液（可添加0.1% BSA或Tween-20）溶解，配制成母液（1mg/mL），現(xiàn)配現(xiàn)用；工作濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系梯度優(yōu)化，常規(guī)范圍0.5-10 μg/mL；
- 孵育控制：孵育溫度可選擇室溫（15-30℃）或4℃，室溫孵育時(shí)間10-30分鐘，4℃孵育可延長(zhǎng)至1小時(shí)，低溫可減少非特異性結(jié)合；
- 洗滌要求：孵育后需用含0.05% Tween-20的緩沖液充分洗滌3-4次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的偶聯(lián)物，降低背景信號(hào)；
- 避光操作：全程避光（可用錫箔紙包裹容器），避免熒光染料光漂白，影響檢測(cè)效果；
- 對(duì)照設(shè)置：需設(shè)置生物素陰性對(duì)照（未標(biāo)記生物素的抗體）和熒光陰性對(duì)照（未偶聯(lián)AF488的鏈霉親和素），排除非特異性信號(hào)干擾。
2. 場(chǎng)景A：細(xì)胞免疫熒光染色（固定細(xì)胞）
試劑準(zhǔn)備：Alexa Fluor 488-Streptavidin凍干粉10 μg，PBS緩沖液（pH 7.4，含0.1% BSA），生物素化一抗，固定液（4%多聚甲醛），通透液（0.1% Triton X-100），洗滌緩沖液（PBS+0.05% Tween-20）。
操作步驟：
1. 細(xì)胞爬片培養(yǎng)至適宜密度，用4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘；
2. 加入0.1% Triton X-100通透液，室溫孵育10分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘；
3. 用含0.1% BSA的PBS封閉30分鐘，去除封閉液，無(wú)需洗滌；
4. 加入稀釋好的生物素化一抗，4℃孵育過(guò)夜或室溫孵育1小時(shí)，洗滌緩沖液洗滌3次，每次5分鐘；
5. 用含0.1% BSA的PBS稀釋Alexa Fluor 488-Streptavidin至工作濃度（1-5 μg/mL），滴加至細(xì)胞爬片上，室溫避光孵育20分鐘；
6. 洗滌緩沖液洗滌4次，每次5分鐘，最后用PBS洗滌1次；
7. 滴加抗淬滅封片劑，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察（激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)519nm）。
3. 場(chǎng)景B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（細(xì)胞表面標(biāo)志物）
試劑準(zhǔn)備：Alexa Fluor 488-Streptavidin母液（1mg/mL），生物素化表面標(biāo)志物抗體（如CD4），PBS緩沖液（含2% FBS），洗滌緩沖液（PBS+0.05% Tween-20），離心管，流式細(xì)胞儀。
操作步驟：
1. 收集培養(yǎng)好的細(xì)胞，1000 rpm離心5分鐘，棄上清，用PBS洗滌1次；
2. 用含2% FBS的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10? cells/mL，分裝入離心管；
3. 加入適量生物素化抗體，室溫避光孵育30分鐘，洗滌緩沖液洗滌2次，每次1000 rpm離心5分鐘；
4. 用含2% FBS的PBS稀釋Alexa Fluor 488-Streptavidin至2-5 μg/mL，加入離心管中，室溫避光孵育20分鐘；
5. 洗滌緩沖液洗滌2次，用適量PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)519nm），分析數(shù)據(jù)。
4. 場(chǎng)景C：Western blot檢測(cè)（生物素標(biāo)記蛋白）
試劑準(zhǔn)備：Alexa Fluor 488-Streptavidin母液，轉(zhuǎn)印膜（PVDF或NC膜），封閉液（5%脫脂牛奶/TBST），TBST洗滌緩沖液，熒光成像儀。
操作步驟：
1. 完成蛋白電泳、轉(zhuǎn)印后，將轉(zhuǎn)印膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)；
2. TBST洗滌緩沖液洗滌膜3次，每次5分鐘；
3. 用TBST稀釋Alexa Fluor 488-Streptavidin至1-3 μg/mL，將膜浸入稀釋液中，室溫避光孵育30分鐘；
4. TBST洗滌膜4次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的偶聯(lián)物；
5. 熒光成像儀下觀察（激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)519nm），記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題
1. 禁忌與安全
- 操作時(shí)佩戴手套、護(hù)目鏡和口罩，避免直接接觸皮膚、黏膜和眼睛；不慎接觸后立即用大量清水沖洗15分鐘；
- 全程避光操作，包括溶解、稀釋、孵育和洗滌過(guò)程，防止熒光染料光漂白，影響信號(hào)強(qiáng)度；
- 儲(chǔ)存時(shí)需密封嚴(yán)密，置于-20℃避光環(huán)境，避免反復(fù)凍融（建議將母液分裝成小份，單次使用）；
- 避免使用含生物素的試劑（如某些血清、RPMI 1640培養(yǎng)基）和高濃度巰基還原劑，前者會(huì)與鏈霉親和素結(jié)合，后者會(huì)破壞熒光染料結(jié)構(gòu)；
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，廢液和廢棄物需按生物試劑廢棄物規(guī)范處理，不可隨意丟棄；
- 不同批次產(chǎn)品不可混合使用，避免影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。
2. 常見(jiàn)問(wèn)題與解決
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問(wèn)題
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可能原因
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解決方案
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熒光信號(hào)弱
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偶聯(lián)物濃度過(guò)低、孵育時(shí)間不足、光漂白、生物素標(biāo)記效率低
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提高工作濃度至2-5 μg/mL；延長(zhǎng)孵育時(shí)間；全程避光；優(yōu)化生物素標(biāo)記條件
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背景信號(hào)高
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洗滌不充分、封閉不足、偶聯(lián)物過(guò)量、非特異性結(jié)合
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增加洗滌次數(shù)和時(shí)間；延長(zhǎng)封閉時(shí)間；降低偶聯(lián)物濃度；4℃低溫孵育
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熒光淬滅快
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操作未避光、抗淬滅劑使用不當(dāng)、偶聯(lián)物儲(chǔ)存不當(dāng)
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全程避光；使用熒光抗淬滅封片劑；母液分裝，-20℃密封保存
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無(wú)特異性信號(hào)
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生物素標(biāo)記失敗、偶聯(lián)物失活、緩沖液含生物素或還原劑
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重新進(jìn)行生物素標(biāo)記；更換新鮮偶聯(lián)物；使用無(wú)生物素、無(wú)還原劑的緩沖液
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流式檢測(cè)信號(hào)串?dāng)_
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熒光通道設(shè)置不當(dāng)、與其他熒光染料光譜重疊
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調(diào)整流式細(xì)胞儀通道參數(shù)；選擇光譜分離良好的熒光染料聯(lián)用（如AF488+AF647）
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四、配方與試劑搭配（高效組合）
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組合
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適用場(chǎng)景
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優(yōu)勢(shì)
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 生物素化一抗
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免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot
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無(wú)需直接標(biāo)記一抗，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，信號(hào)特異性高、亮度強(qiáng)
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 生物素化核酸探針
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原位雜交（FISH）、核酸檢測(cè)
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信號(hào)放大效果顯著，提升低豐度核酸靶標(biāo)的檢測(cè)靈敏度
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 抗淬滅封片劑
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免疫熒光成像（固定細(xì)胞/組織切片）
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延緩熒光淬滅，延長(zhǎng)觀察時(shí)間，保證成像質(zhì)量
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 含BSA緩沖液
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所有實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景
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減少非特異性結(jié)合，穩(wěn)定偶聯(lián)物活性，降低背景信號(hào)
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + AF594/AF647標(biāo)記偶聯(lián)物
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多色熒光成像、多指標(biāo)流式檢測(cè)
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光譜分離良好，無(wú)信號(hào)串?dāng)_，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)
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